Il ruolo dei meccanismi epigenetici nello sviluppo di cellule tumorali

Enrica Capelli

Enrica Capelli

Ricerche condotte all’Università degli Studi di Pavia identificano microRNA differenzialmente espressi nei tumori: un’importante base di partenza per nuovi metodi diagnostici e nuovi approcci terapeutici. Abbiamo incontrato la professoressa Enrica Capelli dell’Università di Pavia che ci ha esposto i risultati delle sue ricerche, in merito alla regolazione dell’espressione genica in risposta a segnali ambientali e alle future implicazioni per la cura delle neoplasie.

Prof.ssa Capelli, può farci un resoconto della sua attività scientifica?
La mia attività riguarda soprattutto lo studio di meccanismi che influenzano il differenziamento cellulare. In passato, mi ero interessata al differenziamento di cellule del sistema immunitario con attività citotossica anti-tumorale e in questo ambito avevo messo a punto un modello cellulare di differenziamento in vitro con opportuni cocktail di citochine. In questo modello erano stati studiati vari aspetti del problema, correlando per esempio il fenotipo, le funzioni e l’espressione genica. Lo studio ha permesso di identificare un aumento di espressione differenziale di geni correlati a processi differenziativi in linfociti attivati e in linfociti non attivati e di identificare, nei messaggeri di questi geni, alcune sequenze presenti normalmente in regioni geniche non codificanti. Una di queste sequenze, denominata «Bov A-2» era risultata particolarmente interessante, perché la sua espressione viene indotta da segnali di stress e per la sua capacità di influenzare la stabilità di RNA messaggeri, di conseguenza era stata ipotizzata una sua funzione nella regolazione dell’espressione genica in risposta a segnali ambientali, quella che viene definita come «regolazione epigenetica». In seguito, l’attività di ricerca si è focalizzata sul ruolo dei meccanismi epigenetici nello sviluppo di cellule tumorali, in particolare sul ruolo dei piccoli RNA non codificanti (microRNA) nel controllo della espressione di oncogeni/oncosopressori, grazie anche alla disponibilità di nuove tecnologie in grado di identificare con alta precisione queste sequenze.apertura

Ci può parlare del ruolo degli RNA non codificanti nella regolazione dell’espressione genica?
Attualmente, ho appena concluso un lavoro per l’identificazione di micro RNA differenzialmente espressi nell’epatocarcinoma. Questo progetto è iniziato nel 2009 in collaborazione con l’IRCCS-San Matteo di Pavia e la Fondazione CMT (Cura Mininvasiva Tumori-onlus) ed ha previsto la messa a punto di metodiche di sequenziamento di nuova generazione del miRNAoma tumorale e non tumorale e la messa a punto di metodi di analisi bioinformatica per l’identificazione di microRNA. Il primo passo del lavoro è stata una attenta scelta delle tecnologie e delle metodiche più adatte, accompagnata da una formazione specifica dei ricercatori da impiegare nel progetto, quindi si è proceduto al lavoro vero e proprio con l’utilizzo di sequenziatori NextGen. Un nuovo progetto simile sta per iniziare e riguarda il gliobastoma. Verranno presi in considerazione l’infiammazione della glia e la trasformazione tumorale. Contemporaneamente alla analisi del miRNAoma con metodiche di sequenziamento, nel mio laboratorio, sono state messe a punto tecniche di estrazione di microRNA da fluidi biologici di varia natura (saliva, siero, plasma, sangue, terreno di coltura) e su questi campioni vengono testati, con sonde disegnate su microRNA di interesse selezionati dai database o individuati tramite sequenziamento, i livelli quantitativi di espressione di queste sequenze, mettendo a confronto condizioni normali e patologiche. Questo tipo di analisi è stato applicato, per esempio, per studiare alcuni microRNA che regolano l’angiotensina e i recettori per l’angiotensina in soggetti con fibrillazione atriale e per studiare l’effetto dei campi elettromagnetici sulla regolazione dell’enzima BACE 1 in cellule di pazienti con Alzheimer esposte in vitro a campi elettromagnetici a bassa frequenza. Stiamo ora per iniziare uno screening basato su miRNA circolanti in pazienti a forte rischio di tumore al polmone. Utilizzeremo microRNA marcatori già individuati da studi estensivi, condotti da vari gruppi di ricerca, pubblicati negli ultimi anni.

In particolare come funziona il meccanismo?
Gli RNA non codificanti sono trascritti genici che non vengono tradotti e quindi i geni che codificano per questi RNA non portano alla produzione di una proteina. Ci sono vari RNA non codificanti che svolgono diverse funzioni, per esempio gli RNA ribosomiali (rRNA), gli RNA transfer (tRNA). Ci sono RNA non codificanti che vengono denominati long non coding RNA (lncRNA), che sono costituiti da trascritti lunghi più di 200 nucleotidi. Tali RNA sono oggetto di ricerca odierna e sembrano essere coinvolti in molti meccanismi biologici: splicing, stoccaggio di microRNA, processi trascrizionali e post-trascrizionali, e sono state descritte una serie di patologie associate alla loro disregolazione. Ci sono poi i microRNA (miRNA) che sono sequenze costituite da circa 22 nucleotidi e sono la classe più studiata dei piccoli RNA non codificanti. Il primo miRNA fu identificato nel Nematode C. elegans, successivamente furono identificati vari miRNA anche nelle piante. Queste sequenze sono trascritte nel nucleo e subiscono vari processi di maturazione dopo di che vengono rilasciate all’esterno della cellula associate a complessi proteici o lipidi oppure vengono incapsulati all’interno di esosomi, a loro volta rilasciati all’esterno della cellula. I miRNA agiscono a livello post-trascrizionale e inibiscono la traduzione dei propri bersagli, hanno, quindi, un ruolo di regolazione negativa dell’espressione genica. Essi si legano a RNA messaggeri che contengono sequenze complementari alle proprie e possono avere diversi modi di agire, a seconda della complementarità che vi è tra il miRNA e il suo target. Quando c’è complementarità imperfetta causano una riduzione dell’espressione del messaggero target e, per inibire la traduzione, di solito legano le regioni non tradotte al 3’ (3’UTR) del messaggero per le quali presentano omologia. Quando, invece, c’è complementarità perfetta i miRNA causano la completa degradazione del bersaglio che non può più essere tradotto; in questo caso trovano la loro regione di omologia nell’ORF (Open Reading Frame) o nella sequenza codificante. Altre sequenze simili ai miRNA sono i siRNA che agiscono determinando la degradazione dell’RNA bersaglio attraverso un meccanismo definito di RNA interferenza (RNAi). I siRNA derivano da lunghe molecole di RNA a doppia elica, prodotte da elementi genetici normalmente silenti o estranei alla cellula quali trasposoni, virus o transgeni. Il meccanismo di RNA interferenza rappresenta un elemento di difesa contro l’invasione di elementi genetici estranei per la salvaguardia della stabilità del genoma, essi agiscono per complementarità perfetta.

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miRNA
I miRNA sono coinvolti nella regolazione di molti processi fisiologici e vari studi hanno rilevato variazioni di espressione in seguito a stimoli di varia natura (stress, attivazione cellulare, apoptosi, differenziamento tumorale) fino a individuare la presenza di specifiche «signatures» associate a una determinata condizione. Le caratteristiche biologiche di queste molecole le rendono adatte a essere applicate in ambito diagnostico. I miRNA sono presenti in un ampio range di fluidi biologici e il profiling dei miRNA circolanti è stato utilizzato in vari studi per identificare miRNA marcatori. I miRNA sono di grande interesse anche in terapia: possono per esempio essere utilizzati, opportunamente veicolati, come antagonisti per contrastare l’azione di miRNA che inibiscono oncosoppressori, o per mimare la funzione di miRNA endogeni (miRNA mimic), allo scopo di aumentarne il livello di espressione, se già presenti, o di simulare miRNA nativi ove non esistenti.

Studi futuri
Siamo a conoscenza che esiste un nesso importante tra alimentazione, ambiente, risposta immunitaria e tumori. Su modelli cellulari umani in vitro è stata vista una modulazione dell’espressione di microRNA in seguito a trattamento con estratti naturali di piante o in seguito a esposizione a campi elettromagnetici. La professoressa Capelli ritiene che l’utilizzo di queste piccole molecole, con la possibilità di avvalersi delle tecnologie più avanzate, consenta di ottenere molti dati utili per definire l’effetto di fattori esogeni, con approcci sperimentali semplificati e senza utilizzare metodiche invasive in modelli animali in vivo.

di M. Colombini

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