Microscopia 2.0: un nuovo paradigma

Immagine a superisoluzione ottica tridimensionale confrontata con imagine convenzionale dell’impalcatura del citoscheletro. I falsi colori denotano la profondità spaziale. (Cortesia Francesca Cella Zanacchi e Alberto Diaspro, IIT)

Immagine a superisoluzione ottica tridimensionale confrontata con imagine convenzionale dell’impalcatura del citoscheletro. I falsi colori denotano la profondità spaziale. (Cortesia Francesca Cella Zanacchi e Alberto Diaspro, IIT)

Nuove frontiere in ambito diagnostico si sono schiuse grazie a una innovazione tecnologica che offre un metodo per misurare le dinamiche di sistemi biologici anche dal vivo. Il professor Alberto Diaspro è direttore del Dipartimento di Nanofisica all’Istituto Italiano di Tecnologia e coordinatore del progetto di ricerca che ha sviluppato una nuova tipologia di microscopio ottico i cui campi di applicazione potranno essere molteplici, dalle neuroscienze alla comprensione delle malattie oncologiche.

In che cosa consiste la microscopia ottica e in cosa si differenzia da quella elettronica?
La microscopia ottica, sfruttando quella porzione di radiazione elettromagnetica classificata come regione della luce visibile, permette di stimolare il vivente in modo da fargli emettere una risposta, sempre sotto forma di luce, che verrà codificata in una immagine. La risoluzione spaziale risulta limitata dal fenomeno della diffrazione a circa 200 nm. Tale limitazione è presente anche in microscopia elettronica ma l’utilizzo di elettroni permette di raggiungere, con alcuni accorgimenti, le frazioni di Angstrom (1 nm= 10 Angstrom). Lo scotto da pagare con il microscopio elettronico è quello di dover bloccare lo stato del campione e di introdurre una preparazione e condizioni di lavoro che «congelano» la situazione in uno stato preciso. Il microscopio ottico, per la natura della radiazione, perturba scarsamente il vivente e può essere utilizzato per inseguire fenomeni cellulari e molecolari nel tempo. Per questo, oggi, l’ottenimento di super risoluzione porta il microscopio ottico in forte competizione con l’elettronico mantenendo tutti i vantaggi del caso per l’esplorazione del vivente.

Ci può parlare del nuovo «supermicroscopio ottico», quali sono le innovazioni apportate alla microscopia ottica?
Riguardo alla supermicroscopia 2.0, abbiamo introdotto, per la prima volta, la combinazione tra la metodica pCF (pair correlation analysis) e la nanoscopia ottica STED (STimulated Emission Depletion). Abbiamo utilizzato sia capsidi marcati con circa 100 molecole fluorescenti che sistemi cellulari. Nel lavoro viene mostrato come sia possibile, per la prima volta, «inseguire» il movimento di singole molecole all’interno di un sistema cellulare avvalendosi della metodica di deplezione forzata della fluorescenza e dell’analisi pCF che consente di produrre immagini con un dettaglio inferiore a 100 nanometri (cento miliardesimi di metro), superando i consueti limiti di risoluzione delle microscopia ottica che si fermano a 200 nanometri. Grazie al nuovo metodo si è riusciti a mettere a fuoco le particelle virali del virus dell’epatite B, le quali posseggono un diametro di circa 80 nanometri, individuando dettagli associati al trasporto di proteine all’interno del nucleo di una cellula, completamente nascosti allo strumento convenzionale (il fenomeno avviene a una scala spaziali di 100-150 nanometri). In particolare è stato possibile definire chiaramente l’esistenza di barriere per la diffusione e il trasporto molecolare. La differenza con la microscopia ottica «classica» risiede principalmente nel miglioramento della risoluzione sia spaziale che temporale al livello della nanoscala. Negli ultimi anni abbiamo sviluppato diverse piattaforme per supermicroscopia adattabili a diverse situazioni. Il raggiungimento dell’elevata risoluzione spaziale è stato solo il primo passo. Spingere il supermicroscopio a circa 30-40 nm è come si dice «challenging». Parallelamente vi sono altri requisiti da rispettare come l’affidabilità, il costo e il contenimento del livello di perturbazione del vivente. Tra le innovazioni più interessanti abbiamo anche progettato e sviluppato il microscopio a superisoluzione tridimensionale basato su un foglietto di luce con lo scopo di portare la supermicroscopia 2.0 su organi e tessuti e svincolarla dalla necessità di realizzare preparati su vetrini. In quest’ottica è stato progettato il supermicroscopio multifotonico, tecnicamente a singola lunghezza d’onda per eccitazione e aumento della risoluzione, con l’intenzione di favorire diagnosi direttamente su pazienti, per esempio durante una sessione operatoria, per eludere, eventualmente, la necessità di biopsie. Inoltre, poiché la raccolta d’informazioni nello spazio tridimensionale richiede, in alcuni casi, elevata velocità al processo di formazione delle immagini è stato progettato e realizzato un supermicroscopio dotato di lente liquida. Una lente in olio siliconico che permette di variare il fuoco a frequenze elevate, tra 100 kHz e 1 MHz, grazie all’utilizzo di onde acustiche: il «tempo reale» diviene una «realtà».

Lo sviluppo di questo strumento ha richiesto di implementare tecnologie correlate a esso?
Il supermicroscopio nasce proprio dall’implementazione di due tecnologie avanzate a completamento una dell’altra. Da un lato si è affinata la possibilità di misurare processi di diffusione di singole molecole in sistemi biologici. La diffusione delle molecole biologiche è estremamente importante perché riguarda lo scambio d’informazioni e di segnali tra cellule. Quando questo scambio diviene anomalo significa che il sistema biologico nel suo complesso potrebbe subire dei malfunzionamenti. In particolare questo avviene per malattie degenerative di tipo oncologico e neurologico. Nel caso di trattamento farmacologico questo tipo di approccio permette di valutarne l’effetto in «tempo reale» molecola per molecola. Tuttavia se lo studio della diffusione venisse condotto in un regime di dettaglio spaziale convenzionale, la valutazione del processo diffusivo potrebbe avere un alto margine di errore. Per questo motivo abbiamo coniugato alla capacità di inseguire eventi molecolari nel tempo la super risoluzione spaziale ottenibile dalla metodica STED. La STED a oggi ha raggiunto il limite di 2.4 nm in risoluzione spaziale ed è «normalmente» utilizzata al livello di risoluzione di 30-40 nm. L’unione delle due metodiche permette di ottenere insieme supersioluzione spaziale e temporale. Inoltre, utilizzando un appropriato strumento di analisi computazionale, è possibile individuare nei sistemi biologici, alla nanoscala, barriere o varchi per la diffusione delle molecole biologiche.

Alberto Diaspro (foto di Agnese Abrusci, IIT).

Alberto Diaspro (foto di Agnese Abrusci, IIT).

Quali sono i futuri temi di ricerca?
Abbiamo tre punti strategici da sviluppare: il consolidamento delle tecniche a super risoluzione con l’introduzione di nuovi approcci tecnologici, dalla lente liquida per acquisizioni ultraveloci a strategie intelligenti per l’interrogazione del vivente; la progettazione di moduli miniaturizzati, in termini di ottica, elettronica, meccanica,e fluidica, per creare un supermicroscopio biocompatibile possibilmente impiantabile o montabile in modo modulare sulla testa di un endoscopio da utilizzarsi per esempio in sede chirurgica; infine l’approfondimento del possibile apporto di nuove tecnologie: dalla nanoscopia correlativa alla tecnologia in grafene, dai nuovi materiali intelligenti all’uso di finestre temporali di acquisizione spinte e approcci computazionali avanzati. Si tratta di dotare il supermicroscpio 2.0 di Hi-Fi, alta fedeltà, prestazioni al limite delle possibilità tecnologiche non solo correnti ma futuribili.

Microscopia 2.0
Rappresenta il nuovo paradigma della microscopia spinta a risoluzioni spaziali e temporali inimmaginabili fino a pochi anni fa. È anche la miniaturizzazione del microscopio ottico a super risoluzione. Immaginate di poter costruire un minuscolo supermicroscopio inseribile sotto cute o un microscopio ripiegabile e piatto con tecnologia in grafene. Il microscopio diventa un sistema flessibile e sintonizzabile sull’esigenza del momento.

Laboratory Advanced Microscopy Bioimaging Spectroscopy (www.lambs.it)
Nato nel 2003 in forma stabile al Dipartimento di Fisica dell’Università degli Studi di Genova è composto da circa 24 ricercatori svolge le attività di ricerca all’Istituto Italiano di Tecnologia sotto l’ombrello del neonato Nikon Imaging Center, centro di eccellenza Nikon e parente dei centri di Harvard, San Francisco, Chicago, Heidelberg, Hokkaido, Londra, Singapore, Parigi (www.nic.iit.it). Si tratta di un gruppo internazionale di scienziati di diversa estrazione culturale e provenienti da diversi paesi – Italia, Spagna, USA, Cuba, Ungheria, Germania – che svolgono ricerca in microscopia ottica con particolare interesse allo studio del vivente.

di M.Colombini

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