Saggi in vitro per valutare la genotossicità

Scientist pipetting medium into 12-well plateIl protocollo del saggio dei micronuclei è piuttosto rapido e semplice: allo stato attuale lo si conduce su cellule di ratto ma sono allo studio nuovi modelli biologici come l’epidermide umana ricostituita e il saggio sugli embrioni di pollo. Il primo passo consiste nell’individuare la concentrazione adeguata da testare della molecola in esame. Una volta stabilita la concentrazione si aggiunge la molecola al terreno di crescita di una coltura cellulare insieme a estratti enzimatici in grado di indurre, l’eventuale, attivazione metabolica. Dopo il periodo di incubazione si quantificano i micronuclei, con un opportuno colorante per DNA che evidenzia sia il nucleo sia gli agglomerati di acidi nucleici presenti nel citoplasma (il colorante classico è il Giemsa). La frequenza di micronuclei, da cui poi è calcolato il potenziale genotossico della molecola, viene espressa come il numero di cellule binucleate contenenti micronuclei. Il test dei micronuclei è condotto in parallelo con il Comet test. Nel saggio si utilizzano cellule provenienti da culture cellulari che sono esposte al potenziale agente mutageno. Successivamente al periodo di incubazione le cellule sono lisate con un detergente e sottoposte a elettroforesi per visualizzare il materiale genetico. Dopo l’elettroforesi il DNA è trattato con un particolare colorante che può essere visualizzato al microscopio a fluorescenza. Se il nucleo cellulare non presenta danni in seguito all’esposizione del composto in esame il nucleo apparirà al microscopio integro mentre se vi sono danni il DNA fuori uscito dal nucleo migrerà durante l’elettroforesi e apparirà come una struttura allungata. Il saggio dei micronuclei (OECD 487) è inoltre affiancato dal test in vitro di Ames (OECD 471), un saggio più semplice e rapido condotto su particolari ceppi di batteri (salmonella), dal test di mutazione genica in cellule di mammifero (OECD 476), che valuta potenziali variazioni della sequenza genica e il test sulle aberrazioni cromosomiche (OECD 473), in grado di evidenziare traslocazioni e delezioni dei cromosomi.

di E. Brunelli – PhD, Biotechnology- Università del Piemonte Orientale

 

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